CRISPR - CAS sistemi, sadeliği, yüksek özgüllüğü ve verimliliği nedeniyle gen düzenleme alanında devrim yaratmıştır. Ancak, herhangi bir teknoloji gibi, sınırlamasız değildir. CRISPR - CAS uygulanmasındaki zorluklardan biri, özellikle karmaşık genomlarda ve belirli hücre tiplerinde yüksek verimli gen düzenleme elde etmektir. Rekombinazlar, genetik rekombinasyonu katalize eden enzimler, CRISPR - CAS sistemlerinin verimliliğini artırmada büyük umut vaat eder. Bir rekombinaz tedarikçisi olarak, gen düzenlemedeki yeni olasılıkların kilidini açmak için bu güçlü enzimlerin CRISPR - CAS ile nasıl entegre edilebileceğini keşfetmekten heyecan duyuyorum.
CRISPR - CAS sistemini anlamak
CRISPR - CAS sistemi, bakterilerde ve Archaea'da istila eden virüslere ve plazmidlere karşı doğal bir savunma mekanizmasıdır. Belirli bir DNA dizisini hedefleyen bir kılavuz RNA'dan (GRNA) ve hedeflenen bölgede DNA'yı parçalayan bir Cas nükleazından oluşur. DNA parçalandıktan sonra, hücrenin doğal onarım mekanizmaları devreye girer. İki ana onarım yolu vardır: homolog olmayan - birleştirme (NHEJ) ve homoloji - yönlendirilmiş onarım (HDR). NHEJ hata - eğilimlidir ve genellikle küçük eklemelere veya delesyonlara (indeller) yol açarken, bir donör DNA şablonu sağlandığında HDR kesin genetik değişiklikler sunmak için kullanılabilir.
CRISPR - CAS aracılı gen düzenlemenin etkinliği, CAS nükleaz ve GRNA'nın hedef hücrelere verilmesi, hedef bölgedeki CAS nükleazının aktivitesi ve DNA onarım yollarının etkinliği dahil olmak üzere çeşitli faktörlere bağlıdır. Birçok durumda, HDR'nin düşük verimliliği, özellikle birincil hücrelerde ve in vivo uygulamalarda önemli bir darboğazdır.
Rekombinazlar CRISPR - CAS verimliliğini nasıl artırabilir
1. Homolojiyi Kolaylaştırma - Yönlendirilmiş Onarım (HDR)
Rekombinazlar HDR'nin teşvik edilmesinde önemli bir rol oynayabilir. HDR'deki temel adımlardan biri, donör DNA şablonunun hedef bölgedeki parçalanmış DNA'ya istilasıdır. Bakterilerdeki RECA gibi rekombinazlar, donör DNA üzerinde bir nükleoprotein filament oluşturabilir. Bu filament daha sonra parçalanmış DNA'daki homolog dizileri arayabilir ve HDR'de kritik bir adım olan iplik invazyonunu teşvik edebilir.
Örneğin, CRISPR - CAS sistemi ve donör DNA şablonu ile bir rekombinaz vererek, başarılı HDR olayları olasılığını artırabiliriz. Bu yaklaşımın, çeşitli hücre tiplerinde hassas gen düzenlemenin verimliliğini önemli ölçüde artırdığı gösterilmiştir. Rekombinaz, HDR ile ilişkili kinetik bariyerlerin üstesinden gelmeye yardımcı olur, bu da hücrenin donör DNA şablonunu hata - eğilimli NHEJ yoluna başvurmak yerine onarım için kullanmasını sağlar.
2. Hedeflik özgüllüğünü iyileştirmek
HDR'nin teşvik edilmesine ek olarak, rekombinazlar CRISPR - CAS sisteminin hedefleme özgüllüğünü de artırabilir. Bazı rekombinazlar, yüksek afiniteli spesifik DNA sekanslarını tanıma ve bunları bağlama yeteneğine sahiptir. CRISPR - CAS kompleksi ile etkileşime girecek rekombinaz tasarlayarak, hedef bölgeye CAS nükleazının özgüllüğünü artırabiliriz.
Bu, rekombinazın CAS nükleazına kaynaştırılarak veya CRISPR - CAS ile kombinasyon halinde bir rekombinaz bazlı hedefleme sistemi kullanılarak elde edilebilir. Rekombinaz, CAS nükleazını doğru hedef bölgeye yönlendirmeye yardımcı olabilir ve hedef etkileri azaltır. Kapalı - hedef etkileri, istenmeyen genetik değişikliklere ve potansiyel güvenlik sorunlarına yol açabileceğinden CRISPR - CAS uygulamalarında büyük bir endişe kaynağıdır. Spesifikliği hedefleyen rekombinazlar, CRISPR - CAS sistemini gen terapisinde ve diğer uygulamalarda kullanım için daha güvenilir ve güvenli hale getirebilir.
3. Kromatin bariyerlerinin üstesinden gelmek
Kromatin yapısı, CRISPR - CAS sisteminin hedef DNA'ya erişimine önemli bir engel oluşturabilir. Ökaryotik hücrelerdeki DNA, cas nükleaz ve gRNA'nın hedef bölgeye bağlanmasını sınırlayabilen kromatin oluşturmak için histon proteinleri ile sıkı bir şekilde paketlenir. Rekombinazlar bu kromatin bariyerlerinin üstesinden gelmeye yardımcı olabilir.
Bazı rekombinazlar, kromatin ile ilişkili proteinlerle etkileşime girme ve hedef bölgenin çevresindeki kromatin yapısını değiştirme yeteneğine sahiptir. Bu, hedef DNA'yı CRISPR - CAS sistemi için daha erişilebilir hale getirerek gen düzenlemenin verimliliğini artırabilir. Örneğin, kromatini yeniden şekillendirebilen bir rekombinaz kullanarak, Cas nükleaz ve gRNA'nın hedef bölgeye bağlanmasını arttırabilir ve daha verimli DNA bölünmesine ve daha sonraki onarıma yol açabiliriz.
Rekombinaz ürünlerimiz ve bunların CRISPR - CAS geliştirme potansiyeli
Bir rekombinaz tedarikçisi olarak, CRISPR - CAS sistemlerinin verimliliğini arttırmak için uygun bir dizi yüksek kaliteli rekombinaz ürün sunuyoruz. Rekombinazlarımız, gen düzenleme uygulamalarında optimum performansı sağlamak için dikkatlice saflaştırılır ve karakterize edilir.
Rekombinaz ürünlerimize ek olarak, gen düzenleme verimliliğini daha da arttırmak için CRISPR - CAS ve rekombinazlarla birlikte kullanılabilecek başka enzimler de sunuyoruz. Örneğin,Exonuclease III 2.0Donör DNA şablonunun uçlarını işlemek için kullanılabilir, bu da HDR için daha uygun hale getirir.M - MLV H - 2.0Bazı gen düzenleme stratejilerinde yararlı olabilen ters transkripsiyon için kullanılabilir. VeDNA polimeraz 2.0Donör DNA şablonunu sentezlemek veya onarım işlemi sırasında boşlukları doldurmak için kullanılabilir.
Vaka çalışmaları ve uygulamalar
CRISPR - CAS verimliliğini arttırmak için rekombinazların kullanımını gösteren birkaç başarılı vaka çalışması yapılmıştır. Bir çalışmada, araştırmacılar insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerde (IPSC'ler) genetik bir mutasyonu düzeltmek için bir rekombinaz destekli CRISPR - CAS sistemi kullandılar. CO - CRISPR - CAS bileşenleri ve donör DNA şablonu ile bir rekombinaz vererek, sadece CRISPR - CAS sistemini kullanmaya kıyasla HDR'nin önemli ölçüde daha yüksek bir verimliliği elde edebildiler. Bu yaklaşım, genetik hastalıklar için gen terapisinde potansiyel uygulamalara sahiptir, çünkü hastalıkların kesin düzeltilmesine izin verir.
Başka bir durumda, bitkilerdeki CRISPR - CAS sisteminin hedefleme özgüllüğünü arttırmak için rekombinazlar kullanıldı. Rekombinaz bazlı bir hedefleme sistemi tasarlayarak, araştırmacılar hedef etkileri azaltabildiler ve mahsul bitkilerinde gen düzenlemesinin verimliliğini artırdılar. Bunun, hastalık direnci ve artan verim gibi gelişmiş özelliklere sahip ürünler geliştirmek için kullanılabileceğinden tarımsal biyoteknoloji için etkileri vardır.
Sonuç ve harekete geçme çağrısı
Rekombinazlar CRISPR - CAS sistemlerinin verimliliğini artırmada büyük potansiyele sahiptir. HDR'yi teşvik ederek, hedefleme özgüllüğünü iyileştirerek ve kromatin bariyerlerinin üstesinden gelerek, rekombinazlar CRISPR - CAS teknolojisinin bazı temel sınırlamalarını ele alabilir. Bir rekombinaz tedarikçisi olarak, gen düzenleme alanında çalışan araştırmacılara ve biyoteknoloji şirketlerine yüksek kaliteli ürünler ve teknik destek sağlamayı taahhüt ediyoruz.
CRISPR - CAS uygulamalarınızı geliştirmek için rekombinaz kullanımını araştırmak istiyorsanız, daha fazla bilgi için sizi bizimle iletişime geçmeye davet ediyoruz. Uzman ekibimiz, doğru rekombinaz ürünlerini seçmenize ve deneysel tasarım konusunda rehberlik etmenize yardımcı olabilir. Gen düzenleme alanını ilerletmek ve masaya yeni çözümler getirmek için sizinle birlikte çalışmayı dört gözle bekliyoruz.
Referanslar
- Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, JA ve Charpentier, E. (2012). Uyarlanabilir bakteriyel bağışıklıkta programlanabilir çift RNA - rehberli DNA endonükleaz. Bilim, 337 (6096), 816 - 821.
- Mali, P., Yang, L., Esvelt, KM, Aach, J., Guell, M., Dicarlo, JE, ... & Church, GM (2013). RNA - CAS9 Science aracılığıyla rehberli insan genom mühendisliği, 339 (6121), 823 -
- Li, X., Yang, Y. ve Zhang, Y. (2016). Rekombine etme: Homolog rekombinasyona dayalı bir genetik mühendisliği yöntemi. Doğa Protokolleri, 11 (3), 476 - 492.
- Pinder, JC ve Cheng, AW (2019). CRISPR - CAS9 gen düzenlemesinin iyileştirilmesi DNA - hedefleme rekombinazları. Moleküler Biyolojide Yöntemler, 1970, 273 - 285.