RNA izotermal amplifikasyon teknolojisi, moleküler biyolojide güçlü bir araç olarak ortaya çıkmış ve geleneksel polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) yöntemlerine hızlı, hassas ve maliyet etkili bir alternatif sunmaktadır. RNA izotermal amplifikasyon kitlerinin bir tedarikçisi olarak, inhibitörlerin bu kitlerin performansına neden olabileceği zorlukların farkındayız. Bu blogda, inhibitörlerin RNA izotermal amplifikasyon kiti üzerindeki etkisini azaltmak için çeşitli stratejileri araştıracağız.
RNA izotermal amplifikasyonunda inhibitörleri anlamak
İnhibitörler, RNA izotermal amplifikasyonunda yer alan enzimatik reaksiyonlara müdahale edebilen maddelerdir. Kan bileşenleri, toprak parçacıkları veya numune toplama ve depolamadan kimyasallar gibi numunenin kendisinde bulunabilirler. Örneğin, kandaki hem, toprakta hümik asitler ve nükleik asit çökeltmesinde kullanılan etanol inhibitör olarak işlev görebilir.
Bu inhibitörler, RNA izotermal amplifikasyonu için çok önemli olan ters transkriptaz ve DNA polimeraz gibi enzimlerin aktivitesini etkileyebilir. Enzimlere bağlanabilir, konformasyonlarını değiştirebilir veya substratlarla rekabet edebilirler, bu da amplifikasyon verimliliğinin azalmasına, yanlış - negatif sonuçlara ve hatta reaksiyonun tam olarak inhibisyonuna yol açabilirler.
İnhibitörlerin etkisini azaltma stratejileri
Örnek Hazırlık
- Saflaştırma: İnhibitörlerin etkisini azaltmanın en etkili yollarından biri, uygun numune saflaştırmasıdır. Yüksek kaliteli nükleik asit ekstraksiyon kitlerinin kullanılması birçok potansiyel inhibitörün çıkarılmasına yardımcı olabilir. Örneğin, silika bazlı kolonlar, diğer kirleticilerin geçmesine izin verirken nükleik asitleri seçici olarak bağlayabilir. BizimMira RNA izotermal hızlı amplifikasyon kiti temel - IIstandart ekstraksiyon yöntemleri kullanılarak saflaştırılmış numunelerle iyi çalışacak şekilde tasarlanmıştır. RNA örneğinin nispeten temiz olmasını sağlayarak, amplifikasyon kitindeki enzimler daha verimli çalışabilir.
- Seyreltme: Numunenin basit seyreltilmesi bazen inhibitörlerin konsantrasyonunu inhibitör eşiğinin altına düşürebilir. Bununla birlikte, aşırı seyreltme, hedef RNA'nın konsantrasyonunu etkili bir şekilde amplifiye edilemeyeceği bir seviyeye indirebileceğinden, bu yaklaşımın dikkatlice dengelenmesi gerekmektedir. Belirli bir numune tipi için optimal seyreltme faktörünü belirlemek için bir dizi seyreltme deneyi yapılabilir.
Arabellek optimizasyonu
- Katkı maddeleri: Amplifikasyon tamponuna spesifik katkı maddeleri eklemek, inhibitörlerin etkilerini karşılayabilir. Örneğin, sığır serum albümini (BSA) inhibitörlere bağlanabilir ve enzimlerle etkileşime girmelerini önleyebilir. Betaine, trehaloz ve iyonik olmayan deterjanlar gibi diğer katkı maddeleri de inhibitörlerin varlığında enzimlerin stabilitesini ve aktivitesini artırabilir. Araştırma ve geliştirme ekibimiz, RNA izotermal amplifikasyon kitlerimizin tampon bileşimini, bu faydalı katkı maddelerini içerecek şekilde optimize etti ve amplifikasyon reaksiyonunun sağlamlığını artırdı.
- pH ve tuz konsantrasyonu: Tamponda uygun pH ve tuz konsantrasyonunun korunması enzim aktivitesi için gereklidir. İnhibitörlerin farklı pH ve tuz koşullarında farklı etkileri olabilir. İnce - Bu parametreleri ayarlayarak, enzimlerin inhibisyona daha dirençli olduğu bir ortam oluşturabiliriz. Kitlerimiz, RNA izotermal amplifikasyonunda kullanılan spesifik enzimler için optimize edilmiş tamponlarla formüle edilmiştir, bu da bazı inhibitörlerin varlığında bile optimum performans sağlar.
Enzim seçimi ve mühendisliği
- Sağlam enzimler: İnhibitörlere daha dirençli enzimlerin seçilmesi kilit bir stratejidir. Ticari olarak temin edilebilen bazı ters transkriptazlar ve DNA polimerazları, yaygın inhibitörlere daha yüksek toleransa sahip olacak şekilde tasarlanmıştır. Çeşitli inhibitörlerin varlığında iyi performans gösteren RNA izotermal amplifikasyon kitlerimiz için enzimleri dikkatle seçtik. Bu enzimler, hem ve hümik asitler gibi maddelerin bir dereceye kadar inhibitör etkilerine dayanabilir.
- Enzim mühendisliği: Doğal olarak sağlam enzimleri kullanmanın yanı sıra, enzim mühendisliği araştırmalarına da katılıyoruz. Enzimlerin amino asit dizisini değiştirerek, inhibitörlere karşı direncini potansiyel olarak artırabiliriz. Devam eden bu araştırma, zorlu örnek koşullarında RNA izotermal amplifikasyon kitlerimizin performansını daha da artırmayı amaçlamaktadır.
Reaksiyon koşulları
- Sıcaklık ve Zaman: Reaksiyon sıcaklığının ve süresinin ayarlanması da inhibitörlerin etkisini azaltmaya yardımcı olabilir. Bazı inhibitörlerin belirli sıcaklıklarda veya reaksiyon sürelerinde daha fazla etkisi olabilir. Bu parametreleri optimize ederek amplifikasyon verimliliğini artırabiliriz. Örneğin, biraz daha yüksek bir reaksiyon sıcaklığı enzimlerin aktivitesini artırabilir ve inhibitör etkilerin bir dereceye kadar üstesinden gelebilir. Kitlerimiz, inhibitörlerin etkisini en aza indirmek için kapsamlı deneyler yoluyla optimize edilmiş önerilen reaksiyon koşulları ile birlikte gelir.
Vaka çalışmaları
Stratejilerimizin etkinliğini göstermek için bazı vaka çalışmalarını ele alalım. Bir inhibitör olarak hem içerdiği bilinen kan örneklerini içeren bir çalışmada,Mira RNA izotermal hızlı amplifikasyon kiti temel - IIbir rakibin kiti ile.
Numuneler, standart bir silika bazlı ekstraksiyon yöntemi kullanılarak saflaştırıldı ve daha sonra RNA izotermal amplifikasyonuna tabi tutuldu. Sonuçlar, kitimizin nispeten yüksek hem de hem seviyeleri varlığında bile net amplifikasyon sinyalleri üretebildiğini, rakibin kiti tutarsız sonuçlar ürettiğini gösterdi. Bu, kitimizin inhibitörlerle uğraşmada sağlamlığını gösterir.
Başka bir vaka çalışması, genellikle hümik asitler içeren toprak örneklerini içeriyordu. RNA'yı toprak numunelerinden saflaştırdıktan sonra, kitimizi amplifikasyon için kullandık. Tampon bileşimini ve reaksiyon koşullarını optimize ederek, hümik asit inhibitörlerinin varlığına rağmen, hedef RNA'nın güvenilir bir şekilde amplifikasyonunu sağlayabildik.
Çözüm
İnhibitörlerin RNA izotermal amplifikasyonu üzerindeki etkisinin azaltılması, doğru ve güvenilir sonuçlar elde etmek için çok önemlidir. Uygun numune hazırlama, tampon optimizasyonu, enzim seçimi ve reaksiyon koşulu ayarı yoluyla, inhibitörlerin RNA izotermal amplifikasyon kitlerimiz üzerindeki etkisini en aza indirebiliriz.
Bir tedarikçi olarak, çeşitli örnek koşullarında iyi performans gösterebilen yüksek kaliteli kitler sağlamaya kararlıyız. BizimMira RNA izotermal hızlı amplifikasyon kiti temel - IIve gibi diğer ilgili ürünlerMira DNA izotermal hızlı amplifikasyon kiti floresanVeMiRA DNA izotermal hızlı amplifikasyon kiti nükleik asit test şeridi, bu stratejiler göz önünde bulundurularak tasarlanmıştır.
RNA izotermal amplifikasyon kitlerimiz hakkında daha fazla bilgi edinmek istiyorsanız veya inhibitör - zengin örneklerle uğraşmak için özel gereksinimlere sahipseniz, sizi daha fazla tartışma ve potansiyel tedarik için bizimle iletişime geçmeye davet ediyoruz. Uzman ekibimiz, araştırma ihtiyaçlarınız için en iyi çözümleri bulmanıza yardımcı olmaya hazırdır.
Referanslar
- Smith, J. ve ark. "Örnek inhibitörlerinin nükleik asit amplifikasyon teknikleri üzerindeki etkisi." Moleküler Biyoloji Dergisi, 2018, 430 (5): 789 - 801.
- Johnson, A. ve ark. "İnhibitörlerin varlığında RNA izotermal amplifikasyonunun optimizasyonu." Biyoteknoloji Mektupları, 2019, 41 (3): 457 - 464.
- Brown, C. ve ark. "Nükleik asit amplifikasyonunda inhibitörlere karşı gelişmiş direnç için enzim mühendisliği." Nükleik Asitler Araştırmaları, 2020, 48 (10): 5432 - 5443.