Burada, ASFV'yi 20 dakika içinde tespit eden hızlı ve ekstraksiyon- gerektirmeyen bir teşhis platformu olan sCRAM'i (optimal olmayan protospacer bitişik motif (PAM)-aracılı CRISPR RNA ve Cas12a nükleaz ile çoklu enzim izotermal hızlı amplifikasyonu bir araya getiriyoruz) oluşturuyoruz. sCRAM, hızlı bir nükleik asit salınım aşamasını (40 derece, 5 dakika), çoklu enzim izotermal amplifikasyonunu (MIRA) ve optimalin altında bir PAM-aracılı CRISPR/'yi birleştiren tek-tüp reaksiyonuyla bütünleştirir.
Cas12a sistemi (37 derece, 15 dakika), UV ışığı veya yanal akış şeritleri (LFS) aracılığıyla aletsiz görsel okumaya olanak tanır. sCRAM, tek-kopya algılama hassasiyeti gösterir ve beş yaygın domuz patojeniyle (PRRSV, PPV, JEV, PCV ve PRV) çapraz-reaktivite sergilemez. 111 simüle edilmiş ve klinik numunenin (kan, plazma ve swablar dahil) değerlendirilmesi, UV okuması için qPCR ile %100 ve LFS için %98,20 uyum ortaya çıkardı
Her iki yöntem de %100 özgüllük sergiliyor. sCRAM'in basitliği, hızı ve sahaya uyarlanabilirliği, kaynakların sınırlı olduğu ortamlarda merkezi olmayan ASFV gözetimi potansiyelini vurgulayarak salgının kontrol altına alınması için güçlü bir araç sunar.
Bu çalışmada, optimumun altında PAM-aracılı CRISPR/Cas12a'yı çoklu enzim izotermal amplifikasyonu ile entegre eden, hızlı ve sahada{0} konuşlandırılabilir bir ASFV tespit platformu olan sCRAM'i geliştirdik. Test, 20 dakika içinde tek-kopya 1 kopya/uL duyarlılığına ulaşır ve başlıca domuz patojenleriyle hiçbir çapraz-reaktivite göstermez. Kan, plazma ve sürüntü örnekleri arasındaki klinik doğrulama, UV ışık okuması kullanılarak qPCR ile tam uyum ve yanal akış şeritleri aracılığıyla %98,20 doğruluk gösterdi. Basitleştirilmiş çalışma, yüksek hassasiyet ve özgüllük ve görsel sonuç yorumlama özellikleriyle sCRAM, yerinde ASFV gözetimi ve daha geniş{12}}bakım noktası teşhis uygulamaları için güçlü bir potansiyel sunar.
