《Yeni bir CAS13A/CAS12A aracılı yeni bir gelişme"Tek Pot" İkili Genetik olarak değiştirilmiş ürünler için algılama deneyi ekspres
Genetik olarak değiştirilmiş mahsuller dünya çapında yaygın olarak dikildi ve birçok ülke, genetik olarak değiştirilmiş mahsullerin güvenliğini sağlamak için düzenleyici önlemlerini kademeli olarak geliştirdi. Hızlı ve doğru yerinde genetik tespit yöntemlerinin geliştirilmesi tarım ve biyogüvenlik için çok önemlidir ve genetik olarak değiştirilmiş ürünler hakkındaki kamu endişelerini hafifletebilir.
Bu çalışmada, araştırma grubu, genetik olarak modifiye edilmiş mahsullerde CAMV35'lerin ve NOS genetik hedeflerinin eşzamanlı olarak tespiti için çift CRISPR (MR-DCA yöntemi) ile birleştirilmiş yeni bir tek pot reaksiyonu -- MIRA çift tespiti geliştirmiştir.
Deneysel yöntemler
MIRA çift ürünü, birbirine müdahale etmeyen iki bağımsız sinyal üretmek için Cas13a ve Cas12a ikili sistemi ile analiz edilir ve daha sonra floresan rengi, bir aydınlatma cihazı veya çift kanallı okuma elde etmek için iki T çizgisine sahip bir test şeridi ile okunur. Tüm işlem, 20 kopya kadar düşük bir algılama sınırı ile 35 dakikadan daha kısa bir sürede tamamlanır.
(CAMV35'lerin ve NOS'un MR-DCA tespiti prensibi)
Tüm deney üç aşamaya ayrılmıştır: MIRA amplifikasyonu, CRISPR reaksiyonu ve iki sonuç yorumlama yöntemi.
CAMV35S geni Cas13a'nın hedefi olarak kullanılır ve NOS geni Cas12a'nın hedefi olarak kullanılır. Sırasıyla iki çift Mira primeri tasarlandı. Cas13a sistemi sadece RNA'yı tanır, bu nedenle ileri primer bölgesi tasarlanmıştır, bu da daha sonraki transkripsiyon ve CAS13A'nın aktivasyonu için bir T7 promotörü içerir. NOS genine bir Pam eklenir. Yukarıdaki ilaveler, hem CAS13A hem de Cas12a proteinlerinin ilgili CRRNA'larına bağlanabilmesini sağlar ve iki sistem arasında parazit veya çapraz reaksiyon olmamasını sağlar.
Deneysel durum
Duyarlılık ve özgüllük
Numune, MiRA reaksiyonunun floresan yoğunluğunu test etmek için bir gradyan içinde seyreltildi. Floresan yoğunluğunun hala 20 ul'lık bir numune konsantrasyonunda tespit edilebileceği bulunmuştur. Nihayet deney için 20 ul konsantrasyon seçildi.
(Renk geliştirme ve yoğunluk niceliği hesaplaması için farklı örnek konsantrasyonları ve test şeritleri kullanılır)
MR-DCA'nın özgüllüğünü daha da değerlendirmek için araştırma ekibi, transgenik olmayan hayvanların ve transgenik olmayan bitkilerin karışık örneklerini test etti. Sonuçlar, sadece CAMV35 ve NOS içeren transgenik numunelerin yüksek floresan sinyallerine sahip olduğunu, diğer numunelerin floresan yoğunluğunun negatif kontrolünkine yakın olduğunu göstermiştir. MR-DCA, spesifik bir çift hedefli nükleik asit tespit platformu olarak kullanılabilir.
24 mahsul örneği MR-DCA tarafından test edildi. Bunlar arasında 1, 2, 15, 16, 21 ve 22, CAMV35S promotörü içeren transgenik mısır vardır. 7, 8, 23 ve 24, NOS terminatörü içeren hastalığa dirençli transgenik pirinçtir. 3, 4, 11, 12, 13, 14, 17 ve 18, CAMV35S promotörü ve NOS terminatörü içeren transgenik soya fasulyesidir.
(24 örneğin test sonuçları)
Hızlı reaksiyon
Reaksiyon süresi yerinde tespitte önemli bir faktördür. Araştırma ekibi, reaksiyon süresi 10 dakika olduğunda FAM ve HEX'in floresan sinyallerinin bir floresan aracı tarafından tespit edilebileceğini gözlemledi. MIRA, CRISPR reaksiyonu ile birleştiğinde, 15 dakika sonra sarı floresan gözlemledi.
(Farklı MiRA reaksiyon sürelerinde floresan sinyali)
(Farklı Mira reaksiyon sürelerinde test şeritlerinin renk gelişimi ve yoğunluk nicelik hesaplaması)
Deneysel sonuç
Deneysel sonuçlar, çift MIRA'nın iyi bir özgüllüğe sahip olduğunu ve CAMV35'lerin ve NO'ların amplifikasyon ürünlerini doğru bir şekilde elde edebileceğini göstermiştir. Cas13a ve Cas12a sistemleri birbirine müdahale etmeden bağımsız olarak reaksiyona girer. MR-DCA testi, 20 kopyayı 35 dakikalık düşük sıcaklıkta doğru bir şekilde tespit edebilir, bu da sahada genetik olarak değiştirilmiş ürünlerin tespit edilmesinde büyük bir değere sahiptir.
Makale bilgileri
Dergi Adı: 《Gelişmiş Araştırma Express Dergisi
Makale Başlığı: 《Genetik olarak modifiye edilmiş ürünler için yeni bir CAS13A/CAS12A aracılı "tek pot" çift algılama testinin geliştirilmesi
Etki Faktörü: 11.4
Araştırma Ekibi: Wang Xiaofu, Zhejiang Tarım Bilimleri Akademisi