Çoklu enzim izotermal hızlı amplifikasyon ve yanal akış seviye çubuğu tahlili kullanılarak kedi chaphamaparvovirüsünün görünür ve hızlı tespiti
Günlük:Hücresel ve Enfeksiyon Mikrobiyolojisinde Sınırlar
Etki Faktörü:4.6
Kedi chaphamaparvovirus(FeChPV)yeni bir parvovirüstür ve ilk olarak 2019 yılında Kanada'da ishalli kedilerde tespit edilmiştir. Patojenitesi ve moleküler özellikleri belirsizliğini koruyor ve konakçı ve genetik çeşitlilik sergiliyor ve daha fazla epidemiyolojik araştırma gerektiriyor. Şu anda FeChPV tespiti için standartlaştırılmış bir yöntem yoktur.
Çoklu enzim izotermal hızlı amplifikasyon-yanal akış seviye çubuğu (MIRA-LFD) yöntemihızlılık, basitlik ve hassas cihazlara ihtiyaç duyulmaması gibi avantajlar sunarak çeşitli virüslerin tespitinde başarıyla kullanılmaktadır. Araştırma ekibi, tabandan klinik tespitteki zorlukların üstesinden gelmek için FeChPV'ye uygun bir MIRA-LFD yöntemi oluşturdu. Hassas aletlere güvenmeden,MIRA-LFD yöntemi, FeChPV tespitini 37 derecede 20 dakika içinde tamamladı ve diğer virüslerle hiçbir çapraz-reaktivite göstermedi. Tespit limiti 32,3 kopya/μL idi,PCR yöntemine göre 10 kat daha yüksektir. Ayrıca MIRA-LFD yöntemi, 417 ishalli kedi arasında 29 FeChPV-pozitif örnek tespit etti; pozitiflik oranı, iç içe PCR yöntemininkinden biraz daha yüksekti. Bu sonuçlar, FeChPV'yi saptamak için yerleşik MIRA-LFD yönteminin etkili, ekonomik, güvenilir ve basit bir yöntem olduğunu ve FeChPV enfeksiyonunun erken önlenmesine ve kontrolüne katkıda bulunduğunu göstermektedir.
1.Deneysel Yöntemler
Klinik Örnekler:Bu çalışmada kullanılan rektal sürüntü örnekleri, 2022 ve 2024 yılları arasında Guangdong, Henan, Anhui, Zhejiang eyaletleri ve İç Moğolistan Özerk Bölgesi'ndeki veteriner kliniklerinde 632 kediden (417'si ishalli ve 115'i sağlıklı kedi dahil) ve 474 köpekten (342'si ishalli ve 132'si sağlıklı köpek dahil) toplandı.
Nükleik Asit Amplifikasyonu:Çıkarılan DNA nükleik asidi MIRA sistemine eklendi. Rekombinaz ve primerler bir kompleks oluşturdu; yardımcı proteinlerin ve tek-sarmal bağlayıcı proteinlerin yardımıyla, çift-sarmallı DNA şablonunu istila ettiler. Primerler bir D-döngü bölgesi oluşturmak için homolog tamamlayıcı bölgelere bağlanırken, rekombinaz kompleksten ayrıldı. Primerlerin 3' ucuna bağlanan polimeraz, DNA sentezini başlatarak şablondaki hedef bölgeyi katlanarak çoğaltır. Bu süreç hızlı ve verimli bir şekilde gerçekleştirildi, böylece hedef parçanın yalnızca 15 dakikada ultra-hızlı amplifikasyonu sağlandı.
Test Şeridi Renk Gelişimi:Nükleik asit amplifikasyon ürünü 1:10 oranında seyreltildi, test şeridine uygulandı ve sonuçlar 5 dakika sonra okundu.
Nükleik asit amplifikasyonundan test şeridi renginin geliştirilmesine kadar tüm süreç yalnızca 20 dakika sürdü.
Deneyde{0}geleceğin Biyolojik ürünleri kullanıldı:
Çalışmada, tasarlanmış dört özel primer-prob kombinasyonu seti tarandı. Sonuç sunumu için hem agaroz jel elektroforezi hem de nükleik asit test şeritleri kullanıldı. Dört primer-prob kombinasyonunun tümü FeChPV virüsünü tespit edebildi. Agaroz jel elektroforezi sonuçlarına göre FeChPV-4 kombinasyonu en parlak hedef bandını gösterdiğinden sonraki testler için bu kombinasyon seçildi.
Agaroz jel elektroforezi sonuçlarına göre 5, 10, 15 ve 20 dakikalık amplifikasyonun tümü hedef bandı verdi. Hedef bant yoğunluğu 15 dakikalık amplifikasyonda zirveye ulaştı ve bu test için optimal reaksiyon süresi 15 dakika olarak belirlendi. 36 derece, 37 derece, 38 derece, 39 derece ve 40 derecedeki amplifikasyonun tümü hedef bandı üretti; en parlak bant 39 derecede gözlemlendi ve bu tahlil için optimal reaksiyon sıcaklığı olarak 39 derece belirlendi.
(Şekil A: 1: Amplifikasyon 5 dk; 2: Amplifikasyon 10 dk; 3: Amplifikasyon 15 dk; 4: Amplifikasyon 20 dk) (Şekil B: 1: Amplifikasyon 36 derece; 2: Amplifikasyon 37 derece; 3: Amplifikasyon 38 derece; 4: Amplifikasyon 39 derece; 5: Amplifikasyon 40 derece)
2.Algılama Performansı
Hassasiyet:
(Şekil A: Agaroz jel elektroforezi kullanılarak sunulan MIRA sonuçları)
(Şekil B: Agaroz jel elektroforezi kullanılarak sunulan iç içe PCR sonuçları)
(Şekil C: Nükleik asit test şeritleri kullanılarak sunulan MIRA sonuçları)
Numuneler 3,23×10⁶ kopya/μL'den başlayarak 10 kat seri dilüsyonlara tabi tutuldu. Agaroz jel elektroforezi ile iç içe PCR, 3,23×10² kopya/μL'yi stabil bir şekilde tespit edebildi; Agaroz jel elektroforezli MIRA ve nükleik asit test şeritli MIRA'nın her ikisi de 3,23×10¹ kopya/μL'yi stabil bir şekilde tespit edebildi.
MIRA yöntemi, iki farklı sonuç sunum formatı kullanılarak tutarlı hassasiyet gösterdi ve MIRA yönteminin hassasiyeti, iç içe PCR'ninkinden daha üstündü.
özgüllük:
(1: FeChPV, kedigiller chaphamaparvovirüs; 2: FPV, kedigiller panleukopenia virüsü; 3: FeAstV, kedigiller astrovirüs; 4: FBoV, kedigiller bocavirüs; 5: CachaV, köpekgiller chaparvovirüs; 6: negatif kontrol)
Yeni oluşturulan MIRA-LFD yöntemi yalnızca FeChPV'yi tespit etti ve diğer referans virüslerle hiçbir çapraz-reaktivite göstermedi, bu da iyi bir özgüllüğe işaret ediyor.
3.Çalışma Özeti
Bu çalışma, yüksek-hassas cihazlara ihtiyaç duymadan FeChPV'yi tespit etmek için bir MIRA-LFD yöntemi oluşturdu. Yüksek hassasiyet ve özgüllüğe sahip, verimli, ekonomik ve güvenilir bir tespit yöntemi olan MIRA-LFD yöntemi, klinik tespit için daha uygundur ve FeChPV enfeksiyonunun erken önlenmesi ve kontrolü için teknik destek sağlar.
4.AMP-GELECEĞİN BİYOTEKNOLOJİSİ
MIRA çok enzimli izotermal hızlı nükleik asit amplifikasyonu, gerçek anlamda yerinde hızlı tespite olanak tanıyan bir teknolojidir-.
MIRA teknolojisi, oda sıcaklığında (25 derece –45 derece) hızlı (5-20 dakika), hassas, spesifik ve güvenli nükleik asit amplifikasyonu elde etmek için oda sıcaklığında birden fazla fonksiyonel proteinin sinerjistik etkisine dayanan in vivo gen rekombinasyon onarım mekanizmasına dayanmaktadır. MIRA teknolojisinin izotermal yapısı nedeniyle düşük ekipman gereksinimi ve basit işletimi vardır. Minyatürleştirilmiş taşınabilir cihazlar aracılığıyla, çeşitli uygulama senaryolarında ön saf testlerinde uygulanarak POCT, evde test, tarım alanları ve-sahadaki emniyet teşkilatı gibi ortamlara hızlı ve doğru nükleik asit testi yapılabilir. Amp-future Biotech, MIRA teknolojisini temel alarak, hızlı nükleik asit salınım ajanları, izotermal hızlı nükleik asit amplifikasyon reaktifleri, koloidal altın test şeritleri ve minyatür taşınabilir ekipman da dahil olmak üzere bir dizi yerinde hızlı test ürünü geliştirerek, yerinde hızlı moleküler testler için genel bir çözüm oluşturdu-. Ayrıca Amp-future'un MIRA teknolojisi, CRISPR teknolojisi, NGS, SNP, mikroakışkanlar ve daha fazlasıyla birleştirildiğinde uygulama avantajları sunar.
Amp-future Biotech, yukarıda gösterilen-sahadaki hızlı test ürünleri serisine ek olarak şunları da sağlar:
Araştırma Reaktifleri:Temel bilimsel araştırmalar için reaktif hammaddeleri ve teknik desteğin yanı sıra proje literatürü referanslarının sağlanması.
OEM Üretimi:Tüm süreç boyunca bağımsız olarak yüksek-saflıkta, yüksek-aktiviteye sahip bitmiş ürünler üretme ve endüstriyel-ölçekli üretim gerçekleştirme kapasitesine sahiptir.
Projenin Devreye Alındığı Geliştirme:Dizi bilgileri ve dizi hizalama analizi sonuçları, proje primer-prob tasarımı ve sentezi, proje plazmit sentezi ve örnekleri, proje raporları ve sonuçları vb.
Daha fazla bilgi için sormaya hoş geldiniz.