Bu çalışmadaki RPA-CRISPR/Cas12a sistemi, erken-eksprese edilen UL123 genini hedef alarak hızlı (30–40 dakika), ultra-hassas (1 kopya/μL) HCMV saptaması sağlar ve klinik numune testinde geleneksel yöntemlerden daha iyi performans gösterir. Bu yenilik, özellikle bağışıklık sistemi zayıf hastalarda düşük-viral{10}}yüklü enfeksiyonların zamanında teşhis edilmesini sağlar ve HCMV-ile ilgili hastalıkların yönetimini iyileştirmek için CRISPR-tabanlı teşhislerin uygulanabilirliğinin altını çiziyor. Testin basitliği ve verimliliği, kaynakların sınırlı olduğu ayarlar için bir bakım noktası aracı olarak-potansiyelini vurgulamaktadır.
RPA amplifikasyon bölgelerinin modelleri ve kit seçimi.
(A) Amplifikasyon fragmanlarının konumuna ilişkin RPA primer tasarımı. Oklar, P1-P6 primerleri ile güçlendirilmiş fragmanın başından sonuna kadar baz konumlarını gösterir.
(B) 6 HCMV primer seti ile güçlendirilmiş RPA ürününün agaroz jel elektroforez görüntüsü.
(C) Farklı şirketlere ait RPA kitlerinin amplifikasyon verimliliğinin taranması. P: Primer, NC: Negatif Kontrol.
Sonuçlar AmpFuture kitinin en yüksek amplifikasyon verimliliğini sergilediğini gösterdi.
MIRA-CRISPR/Cas12a, PCR - Floresan Prob Yöntemi ve qPCR'nin klinik örneklerdeki pozitif oranlarının karşılaştırılması.
48 klinik hastadan kan ve idrar örnekleri topladık. Bu örneklerden TIANamp Genomik DNA Kiti kullanılarak genomik DNA ekstrakte edildi ve UL122 tespitinin sonuçları PCR-floresan prob yöntemiyle analiz edildi. Sonuçlarımızı klinik tanılarla karşılaştıran yöntemlerimiz, klinik testlerde negatif olan 6 pozitif örnek belirledi.
